三维基因组研究中，HiC、GAM 等主流技术侧重于解析染色质拓扑互作关系，但很难直接获取染色质在细胞核内真实的几何径向位置以及细胞之间的异质性，对基因组的几何特征-特别是单细胞水平的径向位置分布解析能力有限。群体水平技术 GPSeq 可以解析染色质径向分布，却无法在单细胞层面开展相关研究。GAM技术基于随机薄层核切片的DNA测序来捕获拓扑3D基因组结构。如何同时捕获染色质拓扑信息与细胞核内几何空间坐标，是三维基因组领域亟待解决的技术瓶颈。

近日，Nucleic Acids Research发表清华大学高军涛、张奇伟教授团队的合作成果，该工作开发了SequentialGAM（Sequential Genome Architecture Mapping）技术，实现二倍体单细胞染色质几何三维基因组重构，解析染色体、亚区室、TAD、基因在细胞核内部的径向位置，揭示染色质空间稳定性与转录活性的内在关联。

研究团队首先提出假设：如果对单个细胞的细胞核进行逐层连续切片，结合组成型核纤层相关结构域（cLAD）和线性基因组测序等约束信息，即可重建单细胞的基因组几何结构。

随后，该团队开发了基于 GAM 原理的贯序GAM技术：对同一个细胞核开展连续超薄冷冻切片，结合激光显微切割、单细胞全基因组扩增测序，依靠 SNP 区分父本、母本等位基因组。计算层面整合三大约束条件：切片带来的 Z 轴位置、cLAD 核纤层结构域约束、基因组距离空间距离幂律关系，通过损失函数优化，在10 kb 分辨率下输出每条染色体上所有位点的三维空间坐标。研究通过模拟数据集、DNAseqFISH+、cryoFISH、DNAFISH 多重手段完成方法验证。模拟结果显示，相比于传统 GAM 随机切片策略，SequentialGAM 连续切片可以显著提升染色质位点对捕获概率。本研究共分析 10 个 G1 期小鼠胚胎干细胞，获得 121 张核切片测序数据。利用 SequentialGAM，研究团队解析染色质在细胞核内的径向梯度分布特征。研究发现染色体大小与径向位置存在相关性，小染色体、高基因表达的染色体更倾向分布于细胞核中心。晚复制区域、LAD、异染色质标记 H3K9me3 富集在核外周；早复制序列、活跃染色质标记偏向细胞核内部。亚区室 A1A2B1B2B3 呈现从核中心向核外周梯度排布；其中 A1、A2、B3 径向位置跨细胞十分稳定，B1、B2 亚区室的相对径向位置存在显著细胞间动态异质性。

本研究提出新概念qstable TADs（准稳定 TAD 集合）。传统研究聚焦 TAD 内部结构，而该工作关注不同 TAD 之间跨细胞的空间距离稳定性。基于 10 个单细胞距离矩阵，计算全部 6215 个 TAD 两两之间空间距离的细胞间方差，使用 Louvain 算法聚类，筛选得到集合内部 TAD 之间维持相对固定空间距离的 qstable TADs。结果显示稳定性最高的 qstable TAD 簇，CTCF、RAD21 黏连蛋白结合水平更低、基因表达水平更低，提示 TAD 之间的空间稳定性并不依赖强环结构，而与低转录活性相关。qstable TAD 内部转录水平主要由 A/B 亚区室染色质组分决定，但TAD 簇空间稳定性和转录活性不存在简单单调对应关系，转录状态不能等价代表空间结构稳定性。

研究进一步解析基因转录、径向位置、径向位置波动三者之间的关联。高表达基因整体更靠近细胞核中心；基因表达量与径向位置变异系数呈正相关，转录越活跃的基因，不同细胞间径向位置波动越大，该效应主要集中在 A 区室活跃染色质。

该图展示了全新 Sequential‑GAM（基于连续切片的基因组架构映射，也称为序贯基因组架构映射）技术的完整流程：研究人员将单个细胞核切成多张超薄切片（厚度约200nm），通过激光分离、DNA 扩增测序获取基因组位点切片信息，再依靠计算机算法重建染色质在细胞核内部的三维空间结构。利用该技术，作者进一步发现染色质在细胞核中呈圈层式分布：越靠近核中心基因活性越高，部分染色质区域位置可发生互换，同时找到了位置相对固定的准稳定 TAD 结构，揭示了基因活性、所在位置以及染色质结构稳定性三者之间的内在规律。

综上所述，SequentialGAM可以直接得到单细胞内染色质位点核内几何坐标，填补现有技术短板，为解析染色质径向组织、细胞异质性提供全新工具。同时该工作提出 qstable TAD 概念，丰富人们对 TAD 之间空间组织规律的理解，为后续发育、分化场景下细胞核空间调控研究提供新思路。

该工作第一作者为博士研究生李永歌、王开丽。该工作受到国家重点研发计划 (No. 2022YFA1103401 和 No. 2025FY100302) 的资助，致谢北京大学钱敏平教授、清华大学颉伟教授、清华大学李海涛教授在讨论中的建议和帮助，感谢本校冷冻电镜平台的李英博士、本团队博士后李亚书、团队成员马紫珊、严琰、孟乐元、苏昊晨等人，在实验和数据分析中的帮助。

参考文献

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原文链接： https://doi.org/10.1093/nar/gkag794